Однако московской княгине предстояли еще более тяжелые испытания. 19 мая 1389 года на тридцать девятом году жизни умер Дмитрий Донской. За четыре дня до этого Евдокия родила ему младшего сына Константина. Современник записал проникновенный «Плач великой княгини по умершем муже», который стал одним из красивейших поэтических творений Древней Руси: «Зачем умре, жизнь моя дорогая, меня едину вдовою оставив! Солнце мое, рано заходеши, месяць мой светлый, скоро погибаеши, звездо восточная, почто к западу грядеши? Как теперь буду миловать тебя, жизнь моя, как повеселюся с тобою, радость моя! Свете мой светлый, зачем помрачился? Гора великая, зачем гибнеши?»
Дмитрий Донской передал престол своему сыну Василию, завещав, чтобы соправительницей ему была мать. Другим же детям в своем завещании несколько раз повторил фразу: «А вы, дети мои, матери слушайте». Евдокия стала первой женщиной, которая правила Московской Русью, и этот период продолжался около 20 лет. И хотя великая княгиня воздерживалась от непосредственного участия в государственных делах, с ее именем связано одно из значительных событий в истории России. Именно благодаря влиянию матери Василий проявил твердость духа, собрал «малое войско» и вышел навстречу полчищам Тамерлана, подошедшим к границам Руси. Видя такую смелость русских, орда повернула вспять. Евдокия являлась и строгой блюстительницей престолонаследия среди сыновей, сдерживая княжеские междоусобия. Она проявила себя и как умелая хозяйка многочисленных княжеских вотчин. Об этом свидетельствует, в частности, ее активная строительная деятельность, на которую требовались солидные средства.