Появление Лжедмитрия могло обернуться для русских не только потерей государственности, но и разрушением Православной Церкви. Так, одной из главнейших целей в политике самозванца было присоединить русский народ к Римской Церкви через унию. Об этом он письменно засвидетельствовал папе Римскому, за что получил его моральную и финансовую поддержку.
Патриарх Иов старался употребить со своей стороны все меры, чтобы поддержать законную власть и защитить государственный порядок. В устных проповедях и особых посланиях он многократно заверял народ в реальности смерти царевича Дмитрия и всячески обличал самозванца. Он указывал на то, что польский король Сигизмунд использует Лжедмитрия для попрания православной веры и обращения Руси в католичество. После внезапной смерти царя Бориса Иов так же ревностно стал защищать права на русское царство его сына Феодора. Поражают стойкость и мужество первого русского патриарха. Он смело восстал, казалось, один против всех.
Однако в 1605 году приверженцы самозванца убили Феодора и завладели Москвой. После этого они в первую очередь свергли патриарха. «Множество народа, — как свидетельствует сам Иов, — с камнями и палками ворвались в Успенский собор. Войдя в святой алтарь во время литургии, они сорвали с меня святительскую одежду. В ветхом рубище они таскали меня по площадям и позорищам, избивали так, что я был готов умереть». Но его оставили в живых. Патриарший двор был разграблен. Иова всенародно прокляли и сослали в изгнание. Лишь немногие сочувствовали первому патриарху. Многие бояре, архиереи и даже родная мать царевича инокиня Марфа из страха перед самозванцем признали в нем Дмитрия и присягнули ему.