В это время византийцы готовились к Собору, который должен был решить вопрос об унии с Римской Церковью. Русская митрополия была самой крупной митрополией Константинопольской Церкви, и Византии для заключения унии была необходима ее лояльность. Поэтому, чтобы обезопасить себя от неожиданностей, греки постарались максимально отстранить русских от участия в этой антиправославной затее.
Митрополит Исидор, едва приехав в Москву, стал собираться в Италию на предстоящий Собор. Он сумел убедить московского князя в необходимости соединения с Римом без ущерба Православию. «Если уж ты непременно желаешь идти на Собор, — напутствовал митрополита великий князь, — то принеси нам оттуда наше древнее Православие, а нового и чужого мы не примем». Исидор выехал в Италию с огромной свитой в 100 человек. Гигантский обоз в 200 коней вез подарки участникам Собора от великого московского князя. Слух о том, что митрополит едет во «фряжскую землю» обращать «латину» в Православие, распространился по всей Руси. По пути следования митрополита простой люд встречал его с ликованием.
Однако на Флорентийском Соборе в Италии Исидор оказался в числе наиболее активных сторонников Римской Церкви. Его роль в деле заключения унии была столь велика, что римский папа наградил его титулом кардинала и подчинил его власти не только Русь, но и Ливонию с Польшей. Епископа Авраамия Суздальского, который входил в делегацию Исидора, голодом и тюремным заточением принудили к подписанию унии. После подписания акта Авраамий бежал домой в Россию, заручившись поддержкой и благословением святителя Марка Эфесского. В Москве он принес покаяние и рассказал об увиденном на Соборе: «Греки, давшие Руси православную веру, во главе с патриархом и императором оказались отступниками от Православия».